Иммуноферментный анализ альфа-фетопротеина, использование в диагностике заболеваний человека

Альфа-фетопротеин (АФП) — онкофетальный гликопротеин с молекулярной массой около 70 кД. Нормальный уровень АФП в сыворотке крови взрослых от 0 до 12 МЕ/мл. Высокие значения АФП определяются в крови плода и в амниотической жидкости, в крови беременных женщин после 12–15 недель беременности, а также при некоторых онкологических заболеваниях.

В эмбриогенезе АФП синтезируется, главным образом, клетками печени и желточного мешка плода [1, 22]. Из тканей плода АФП проникает в амниотическую жидкость и через плаценту — в кровь матери. У здорового взрослого человека АФП может присутствовать в крови вследствие активизации каких-то репаративных процессов и связанной с ними клеточной пролиферации [7, 65]. Отчасти сходная картина наблюдается и при онкозаболеваниях, когда с возникновением в организме клона малигнизированных клеток немедленно включаются гомеостатические механизмы защитно-регуляторного характера [5, 7]. Однако во многих случаях главную роль в увеличении уровня АФП в организме играют сами раковые клетки, “озлокачествление” которых в той или иной мере всегда сопровождается возвратом к своего рода эмбриональному фенотипу с экспрессией фетальных белков [4, 13]. Особенно характерна гиперпродукция АФП для гепатоцеллюлярного рака и эмбрионально-клеточных опухолей, к огда концентрация его может достигать десятков тысяч МЕ/мл [6, 18, 45].

Свойства и биологическая активность АФП

С помощью моноклональных антител у АФП человека обнаруживают от 5 до 8 антигенных эпитопов [20, 70, 71], причём только 2 из них являются видоспецифическими, остальные имеют перекрест с аналогами АФП одного или нескольких видов животных (мыши, крысы, телёнка, свиньи, собаки, кошки) [71]. До 38% молекулы АФП идентично молекуле сывороточного альбумина [29].

АФП представляет собой гликозилированный белок, причем гликозидная часть имеет непостоянную структуру и состав. При определённых физиологических и патологических состояниях антигенная и гликозидная гетерогенность АФП начинает проявляться особенно ярко. Так, сывороточный АФП при хроническом гепатите содержит 4–6 % фракции АФП с моносиаловым остатком, а АФП из крови больных гепатоцеллюлярной карциномой — до 30 % такой фракции [25]. Очевидно, особенности метаболизма разных по происхождению клеток обуславливают различное представление ими структурных эпитопов АФП. По присутствию фракций АФП с определёнными антигенными или биохимическими характеристиками можно чётко выделить ряд онкологических заболеваний [25, 58, 60, 61].

На уровне организма АФП — многофункциональный белок с селективной клеточной стимулирующей и ингибирующей активностью [1, 22]. Многие растущие эмбриональные и неопластические клетки не только продуцируют, но и поглощают большое количество АФП [2, 3, 57]. Связывание АФП с определёнными рецепторами на мембране запускает рост и пролиферацию клеток или воздействует на процесс клеточной дифференциации [39, 42]. В зависимости от стадии дифференциации или активации клетки начинают делиться или супрессируются.

Разнообразные проявления активности АФП отчасти можно связать с его свойствами транспортного белка, способного образовывать нековалентные комплексы с полиненасыщенными жирными кислотами, билирубином, лектинами, некоторыми стероидными гормонами и другими биологически активными лигандами [1, 14, 22, 46]. Показано, что АФП осуществляет транспорт через мембраны, взаимодействуя с высокоаффинными АФП-рецепторами клеток-мишеней или клеток-экспортёров биологически активных веществ [28, 38, 44].

Установлено, что АФП оказывает влияние на активность клеток иммунной системы, причем он воздействует, как правило, на пролиферирующие клетки [1, 33, 41, 49, 50], не затрагивая их зрелые формы, в частности, Т– и В–лимфоциты [64]. В зависимости от активации клеток АФП стимулирует или супрессирует определённые клоны специфических Т–хелперов и Т–супрессоров [41, 43, 49, 63], подавляет наработку антител и созревание цитотоксических Т–лимфоцитов [49], подавляет пролиферацию лимфоцитов в ответ на митоген [21]. АФП модулирует фагоцитирующую активность макрофагов [48], оказывает влияние на синтез цитокинов моноцитами и другими клетками [15, 48, 49, 68]. In vitro АФП снижает активность натуральных киллеров [19, 33]. Показано его стимулирующее воздействие на рост и пролиферацию фибробластов [3, 55].

Регулирующее влияние АФП на синтез в организме ряда факторов дополняется его синергизмом по отношению к некоторым из них. Например, он способен значительно усиливать активность эпидермального, трансформирующего и инсулиноподобного факторов роста [34, 35, 40]. Установлено, что АФП оказывает влияние на метаболизм стероидных гормонов [15, 16]. Наконец, АФП, также как и фактор некроза опухолей, способен активировать ген апоптоза и запускать механизм запрограммированной гибели раковой клетки. Показано, что эта активность не связана напрямую с его транспортной функцией и опосредуется образованием комплекса АФП с особыми рецепторами на поверхности чувствительной клетки [55, 62].

АФП может препятствовать связыванию вирусов с мембранами лимфоцитов, а в ряде случаев он способен ограничивать атаку аутоантител на специфические сайты и рецепторы клетки [17].

Некоторые исследователи считают, что, действуя на уровне организма, определённые белки могут восстанавливать иммунный гомеостаз вне зависимости от направления первоначального отклонения [12]. По-видимому, это в полной мере можно отнести и на счёт АФП [9]. На проходящих сейчас в нашей стране клинических испытаниях предпринимаются попытки использовать гомеостазирующую активность АФП в отношении иммунной системы для лечения заболеваний с развитой аутоиммунной компонентой (аутоиммунные поражения щитовидной и поджелудочной желез, спаечная болезнь, артриты, артрозы, астма, постинфекционные поражения сердца и почек, myastenia gravis и т. д.).

В эмбриональном развитии АФП, очевидно, играет важную роль в регуляции роста и дифференцировки тканей плода, в защите плода и матери от встречной атаки иммунных систем, в ограничении влияния стероидных гормонов, в частности эстрогенов матери, на плод [1, 12, 22, 63]. По мере завершения органогенеза синтез АФП снижается [24].

При раке активация онкогенов, являющихся по сути заблокированными в норме эмбриональными генами, приводит к продукции эмбриональных форм ферментов, других белковых факторов, обеспечивающих аутокринную регуляцию роста и пролиферации клеток. Экспрессия АФП раковыми клетками — хороший пример действия такого механизма [22]. Подобная активация синтеза АФП, очевидно, происходит и при физиологической регенерации [7, 11, 65]. У взрослых людей без онкологических заболеваний фоновые значения АФП, по-видимому, объясняются именно репаративными процессами в организме. Однако, большая часть АФП при этом скорее всего быстро расходуется в тканях и не поступает в кровоток. Исключения составляют цирроз и гепатиты В и С, при которых уровень АФП в крови больных может возрасти в 10 и более раз [51, 67]. Таким образом, при онкологических заболеваниях АФП может появиться в крови и как компонент репаративного механизма, и как продукт экспрессии раковых клеток. Интенсивнее всего АФП могут продуцировать клетки весь ма агрессивных гепатоцеллюлярной карциномы и гепатобластомы печени, а также клетки эмбрионально-клеточных опухолей [18, 25, 45, 47, 51, 67]. Вместе с тем, раковые клетки не только продуцируют, но и поглощают АФП, что четко выявлено для клеток рака толстой кишки, рака груди, рака лёгкого [23, 57]. Показано, что структура синтезируемого раковыми клетками АФП отличается от структуры физиологического АФП [22, 58, 60]. Можно предположить, что у них разная биологическая роль на уровне опухоли и на уровне целого организма: онкологический АФП обеспечивает рост и защиту опухоли от репаративной системы организма, а физиологический АФП — как раз является компонентом этой системы. В этой связи хочется отметить имеющийся положительный опыт применения АФП и моноклональных антител (МКАТ) к нему для лечении опухолей, клетки которых аккумулируют АФП на своей поверхности. Причём, если в одних случаях терапевтический эффект можно объяснить адресным воздействием цитостатиков, которые были использованы в составе различных компле ксов с АФП или с МКАТ к нему, то в других — положительный результат достигается просто введением АФП или МКАТ к определенным его эпитопам [10, 31, 47].

Уровни АФП в организме. Диагностическая значимость

Разнообразие свойств и особенности проявлений функциональной активности АФП привлекают к нему все большее внимание, как диагностическому маркеру ряда заболеваний и физиологических состояний организма. Наибольшее распространение получили иммуноферментные методы определения общего АФП в сыворотке крови и амниотической жидкости. Главные направления АФП -диагностики — это, во-первых, мониторинг беременности и выявление генетических и соматических пороков развития плода, во-вторых, выявление и контроль эффективности лечения некоторых онкологических заболеваний.

В амниотической жидкости концентрация АФП достигает максимума обычно на 10 неделе беременности [24]. В крови здоровых беременных женщин повышение уровня АФП наблюдается с 11–14 до 31–32 недели беременности, а затем постепенно снижается (см. табл. 1). Через несколько недель после родов АФП в сыворотке крови матери определяется в очень малых количествах [53, 56].

Медиальные значения концентраций АФП при нормальной беременности Таблица 1

Срок беременности

(недели)

Концентрация АФП (МЕ/мл)*

Сыворотка крови

Амниотическая жидкость

15

16

17

18

19

20

29

33

38

43

48

53

14,2

12,3

10,6

9,1

7,7

6,6

Пренатальный скрининг аномалий развития плода по уровню АФП в сыворотке крови матери целесообразно проводить на 15–20 неделе беременности, когда концентрации АФП в крови в большинстве случаев уже достаточно велики и, в основном, коррелируют с состоянием плода. Обычно за нормальный уровень АФП при такого рода скрининге принимают концентрацию АФП в сыворотке не ниже 70% и не выше 200 % от среднестатистического (медиального) значения для данного срока беременности (т. е. в пределах от 0,7 до
2,0 МоМ) [17, 115, 116]. Выход за пределы этого интервала считается зоной риска и требует наблюдения и повторных обследований, а выход за пределы интервала 0,5–2,5 МоМ с достоверностью 90–95% свидетельствует о наличии патологии у плода или у матери (рак, цирроз, гепатит и др.) [8, 53].

Следует отметить, что в разных регионах и в разных группах населения пределы зоны риска и медиальные величины уровня АФП в крови матери могут несколько отличаться. Поэтому диагностические лаборатории на местах должны определить и использовать в расчетах “свой” нормальный уровень АФП. С другой стороны, для каждой внутриутробной патологии могут быть установлены более точные индивидуальные диагностические и прогностические границы.

Повышенный уровень АФП в сыворотке крови матери, как правило, связан с наличием у плода дефектов развития нервной трубки (анэнцефалия, расщепления позвоночника, гидроцефалия), дефектов передней брюшной стенки, врождённых заболеваний почек (поликистоз, нефроз). При этом АФП поступает в амниотическую жидкость и плаценту в аномально большом количестве из-за нарушения структуры органов плода. Высокий уровень АФП дают тератомы плода. Пониженный или низкий уровень АФП отмечается при пузырном заносе и неразвивающейся беременности. Он также может свидетельствовать о наличии у плода синдрома Дауна [53, 60].

Определение АФП в более поздние сроки целесообразно для наблюдения за беременными, попавшими в группу риска, и для прогнозирования угрозы гибели плода у женщин с хроническими нарушениями функций плаценты. Резкое повышение концентрации АФП в крови матери (но не в амниотической жидкости), как правило, сопровождаемое вагинальным кровотечением, обычно наблюдается за
10–14 дней до внутриутробной гибели плода [56].

Раньше для надежной постановки диагноза преждевременного разрыва мембран амниона было необходимо довольно длительное обследование беременной с учетом результатов ряда взаимодополняющих анализов. Не так давно с этой целью было предложено использовать лишь один тест — определение АФП (диагностический уровень 30 нг/мл) в вагинальном или цервикальном секрете [26, 37, 69]. Этот метод даже при минимальном истечении амниотической жидкости обеспечивает высокую достоверность диагноза (95–100 %) [26]. Кроме надежности и скорости этот тест является наименее инвазивным и травмирующим.

При наблюдении за недоношенными новорождёнными детьми показатели уровня АФП в их крови могут быть использованы для прогнозирования и диагностики рецидивирующего апноэ [32].

АФП является важным онкологическим маркёром. Повышенные уровни АФП могут наблюдаться у больных с различными формами рака, однако наиболее характерны они при гепатоцеллюлярной карциноме и гепатобластоме печени, эмбрионально-клеточных опухолях яичка и яичников, а также при плоскоклеточном раке пищевода и при метастазировании некоторых раков в печень. Поскольку период полужизни АФП в организме составляет около 5 суток, наблюдение концентрации АФП в сыворотке крови в течение нескольких недель после удаления опухоли, лучевой терапии или химиотерапии позволяет контролировать их эффективность. Постоянно увеличивающийся уровень коррелирует с плохим прогнозом, медленно снижающийся или замерший — с остаточной опухолью или её метастазами [45].

Надёжность постановки диагноза в онкологии с помощью определения АФП зависит не только от вида рака, но и от стадии его развития, дифференцированности, интенсивности метастазирования, активности иммунной системы и т. д. Например, надёжность теста на АФП при первичной карциноме печени (при дискриминирующем уровне АФП — 50 нг/мл) в целом по всем стадиям составляет 70–72 %, тогда как при первой и второй стадиях — только 15–40 %, а при 3-ей и 4-ой — до 90 % [6, 51, 67]. Вероятно, при высокой активности иммунной системы может нарабатываться большое количество антител к “раковым” изоформам АФП, которые, связывая его в иммунные комплексы [66], повышают процент ложноотрицательных результатов.

Другой аспект демонстрирует большая группа опухолей (рак груди, лёгкого, желудка, толстого кишечника, поджелудочной железы и др.), при наличии которых увеличение уровня АФП в крови отмечается лишь периодически и в концентрациях лишь в 1,5–4 раза превышающих норму (10–
12 нг/мл) [79]. По-видимому, существенную часть общего пула АФП этих мало– и среднепродуцирующих АФП опухолей составляет не раковый, афизиологический АФП, синтезирующийся в результате работы гомеостатического механизма. Кроме того, многие раковые клетки имеют рецепторы к АФП и способны поглощать его, снижая концентрацию АФП в кровотоке [23, 55, 57].

В онкологической практике зачастую справедливо следующее правило: постепенное стойкое увеличение концентрации АФП в крови больных свидетельствует о прогрессировании опухоли
или/и об истощении иммунной системы; резкое возрастание концентрации — об агрессивном метастазировании или о внезапной активизации продуцирующей АФП опухоли; непостоянные, невысокие и колеблющиеся уровни — о наличии низкопродуцирующей, не продуцирующей или поглощающей АФП опухоли.

Не следует забывать, что умеренно повышенные (20–400 нг/мл) уровни АФП могут быть зафиксированы при заболеваниях печени нераковой природы с интенсивной регенерацией её тканей (гепатиты В и С, цирроз) [51, 67]. Обычно незначительное и непродолжительное увеличение концентрации АФП в крови иногда может быть зафиксировано и при репаративных процессах в других тканях организма [65].

Определение АФП в сыворотке крови методом ИФА — лишь один из способов контроля его продукции и метаболизма в организме. Однако этот метод в силу своей простоты, доступности, а также довольно высокой информативности получил наибольшее распространение. В России хорошо известны наборы фирм “ДИА плюс” и “Хоффман–Ля Рош” для определения АФП в диапазоне концентраций 0–200 МЕ/мл. В настоящее время мы выпускаем набор реагентов “АФП–ИФА–Бест–400(200)–стрип”, с помощью которого можно определить концентрацию АФП в исследуемых пробах в двух диапазонох: от 0 до 200 МЕ/мл — для образцов с относительно низкой концентрацией АФП, и от 0 до 400 МЕ/мл — для скрининговых исследований или для образцов с высокими концентрациями АФП (онкология). Стрипированный набор рассчитан на 96 анализов, включая постановку калибровочных проб, а его комплектация позволяет разделить набор на 2 или 4 части, которые могут быть использованы независимо.

Литература к 1 части 
(Новости "Вектор-Бест", № 6, 1998 г.)

  • 1. Абелев Г.И. Онтогенез, 1989, т.20, № 6, с.607-615

  • 2. Батрак С.П. Врачебное дело, 1971, № 10,, с. 127-129

  • 3. Бахуташвили В.И. и др. Вопросы вирусологии, 1985, т.30, № 6, с.693-697

  • 4. Винницкий В.Б. Экспериментальная онкология, 1989, т. 11, № 6, с.59-66

  • 5. Горский Ю.М. и др. В кн. "Гомеостатика живых, технических, социальных и экологических систем". Новосибирск, Наука, 1990

  • 6. Гриневич Ю.А., Каменец Л.Я. "Основы клинической иммунологии опухолей". Киев, "Здоровье", 1986, с.159

  • 7. Корыстов Ю.Н. Успехи современной биологии, 1994, т.114, вып.5, с.412-415

  • 8. Лебедева Р.Н. и др. Новости "Вектор-Бест", № 5, 1997, с.12

  • 9. Меклер Л.Б. Успехи современной биологии, 1978, т.85, вып.1, с.134-151

  • 10. Пак Н.А. и др. "О перспективе использования фетальных протеинов в терапии злокачественных опухолей". Новосибирск, 1997

  • 11. Рощин Е.М. и др. "Материалы 3-й конференции хирургов-гепатологов. Санкт-Петербург, 1995, с.201-202

  • 12. Слепушкин В.Д. и др. "Гомеостатика живых и технических систем". Тезисы докладов VII Всесоюзного семинара, Иркутск, 1989

  • 13. Ширшов С.В. Успехи современной биологии. 1993, т.113, вып.2, с.230-246

  • 14. Эренпрейс Я.Г. Экспериментальная онкология. 1982, т.4, № 6, с.13-18

  • 15. Aussel C., Masseyeff R. Biochem. Biophys. Res. Commun. 119, 1984, 1122-1127

  • 16. Aussel C., Fehlmann M. Prostaglandins Leukot. Med. 1987, v.28, № 3, 325-336

  • 17. Baldini L., Brambilla G. Pharm. Res. Commun. 1972, v.4, № 1, 31-36

  • 18. Brenner T. et al. Tumour Biol. 1984, v5, № 5, 263-274

  • 19. Brumm C. et al. Histopathology. 1989, 14(5), 503-513

  • 20. Cardoso E. et al. J. Clin. Lab. Immunol. 1991, 34(4), 183-188

  • 21. Chacraborty M. et al. Mol. Immunol. 1991, 28(7), 703-710

  • 22. Deutsch H., F. Adv. Canc. Res. 1991, 56, 253-312

  • 23. Esteban C. et al. Int. J. Cancer. 1991, 49(3), 425-430

  • 24. Fischman W. H., Singer R. M. Cancer Res. 1976, 36(11), 4256-4261

  • 25. Fujii V. et al. Tumour Biol. 1993, 14(5), 319-324

  • 26. Gaucheraud P. et al. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 1994, 73(6), 456-459

  • 27. Gazit A. et al. Cell. 1984, 39(1), 89-97

  • 28. Geuskens M. et al. Microscopy Res. and Technique. 1994, 28, 297-307

  • 29. Guilliani M., M. et al. Protein Eng. 1989, 2(8), 605-610

  • 30. Grechanina O. et al. Tsitol. Genet. 1992, 26(4), 20-24

  • 31. Hamada H. et al. Gan To Kagaku Ruoho. 1989, 16(8pt2), 2783-2787

  • 32. Harrison V. C., Peat G. M., Early Hum. Development. 1989, 20, 175-182

  • 33. Hooper D. C. et al. In: Biological activities of alpha-fetoprotein. Vol 1 (Mizejewsky G.J. and Jakobson H. I., eds). CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. 1987, 153-167

  • 34. Keel B.A. et al. Mol. Reprod. Dev. 1991, 30(2), 112-118

  • 35. Keel B.A. et al. Endocrinology. 1991, 129, 217-225

  • 36. Kishida T. Hokkaido Igaku Zasshi. 1994, 69(4), 913-926

  • 37. Kishida T. et al. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 1995, 58(1), 67-72

  • 38. Laborda J. et al. Int. J. Cancer. 1987, 40, 314-318

  • 39. Laderoute M.P. Carcinogenesis. 1994, 10, 125-133

  • 40. Leal J.A. et al. Endocrinology. 1990, 126(1), 669-671

  • 41. Littman B.H. et al. Cell. Immunol. 1977, 30, 35-42

  • 42. Moro R. et al. Tumor Biol. 1993, 14, 116-130

  • 43. Murgita R.A. et al. Nature, 1977, 267(5608), 257-259

  • 44. Naval J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, 82, 3301-3305

  • 45. Nomura N. et al. Cancer. 1989, 64(8), 1700-1707

  • 46. Nunez N.A. et al. Biological activities of alpha-fetoprotein. Vol.1 (Mezejewsky G.J. and Jakobson H.J., eds) CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, 1987, 3-19

  • 47. Ohkawa K., et al. Int. J. Cancer. 1989, 44(3), 489-493

  • 48. Olinesku A. et al. Scand. J. Jmmunol. 1978, 8, 397-415

  • 49. Peck A.B. et al. J. Immunol. 1982, 128, 1134-1140

  • 50. Penninger J.M., Mak T.W. Immunol. Rev. 1994, 142, 231-272

  • 51. Piantino P. et al. J. Nucl. Med. Allied. Sci. 1989, 33(3), 34-38

  • 52. Report of callabor. Stady. Clin. Chim. Acta. 1979, 96, 59-65

  • 53. Ruoslahti E., Seppaela M. Adv. Cancer Res, 1979, 29, 275-346

  • 54. Saraswathi A., Malati T. Cancer Detect. Prev. 1994, 18(6), 447-454

  • 55. Semenkova L. et al. International Seience Tech. Center, grant 091, 1996

  • 56. Seppaela M., Ruoslahti E. Resent Progress in obstetrics and gynaecology, Amsterdam, 1974, 449-462

  • 57. Springolo E. et al. Hepatology. 1989, 9(1), 116-120

  • 58. Suzuki Y. et al. Ann. Clin. Biochem. 1990, 27(2), 121-128

  • 59. Tabor A. et al. Brit Obstet Gynaecology. 1987, 94

  • 60. (cтр 5 и 6) Тaketa E. et al. Cancer Res. 1993, 53(22), 5419-5923

  • 60. (стр 7) идентично 59

  • 61. Taketa K., Hirai H. Electrophoresis, 1989, 10(8-9), 262-267

  • 62. Thompson C.B. Science. 1995, 267(1456-1462)

  • 63. Toder V. et al. Transplantation. 1982, 33(1), 41-44

  • 64. Torres J.V. et al. Mol. Immunol. 1989, 26, 851-857

  • 65. Trojan J. et al. Br. J. Exp. Pathol. 1989, 70(4), 469-478

  • 66. Tsai J.F. et al. Gastroenterology Jpn. 1990,25(3), 388-393

  • 67. Villalta D. et al. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1991, 29(3), 193-196

  • 68. Wang W., Albert E. Hepatology, 1995, 22(3), 921-928

  • 69. Yamada H., Fujimoto S. Arch. Gynecol. Obstet. 1995, 256(2), 57-61

  • 70. Yazova A.K. et al. Immunol. Lett. 1990, 25(4), 325-330

  • 71. Zeng C.Q., Alpert E. Tumour Biol. 1989, 10(1), 4-11

  • 79. (стр8) идентично 6

  • 115. (стр 7) идентично 8

  • 116. (стр 7) идентично 56

Продолжение статьи —в 10 номере “НВБ”. Будут рассмотрены возможности комплексной диагностики с использованием тестов на АФП вместе с тестами на хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) и другие маркеры.